Supervivencia del SARS - Toallitas para mascotas Group Co., Ltd

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 10624 (2022) Citar este artículo

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Los aerosoles o la saliva que contienen el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática pueden contaminar los entornos habitables y los virus pueden transmitirse indirectamente. Para comprender el potencial de supervivencia del virus, se midieron los títulos virales del coronavirus bovino (BCoV), como virus modelo, y del SARS-CoV-2 en superficies porosas y no porosas. La cantidad de BCoV infeccioso recuperado se mantuvo relativamente alta en sustratos no porosos. Sin embargo, disminuyó rápidamente en varias superficies no porosas, como el caucho de nitrilo. El tiempo necesario para alcanzar el límite de detección en las máscaras no tejidas, como sustrato poroso, fue mayor que el de los sustratos no porosos. En sustratos porosos distintos de las máscaras no tejidas, la cantidad de virus recuperado disminuyó rápidamente y luego se mantuvo en un nivel bajo. Se probaron sustratos representativos con SARS-CoV-2. La disminución en la cantidad de virus infeccioso recuperado fue similar a la del BCoV, aunque la del SARS-CoV-2 fue más rápida. El ARN derivado del SARS-CoV-2 también se detectó mediante PCR en tiempo real y permaneció en las superficies mucho más tiempo que el virus infeccioso, en todos los sustratos. Por tanto, es importante medir el título viral para evitar la sobreestimación de la contaminación por virus infecciosos en los ambientes. Nuestros resultados sugieren que la estructura de la superficie no estaba directamente relacionada con la supervivencia viral.

En el caso de las infecciones respiratorias virales, la transmisión del virus a menudo se produce por transmisión directa. La transmisión directa requiere gotitas respiratorias y aerosoles generados por la tos, los estornudos y la conversación. También se cree que los virus respiratorios pueden transmitirse indirectamente1, mediante virus depositados en la superficie de diversos materiales. En el caso del COVID-19, encuestas en hospitales y entornos de cruceros han revelado la presencia del síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en diversas superficies con las que los pacientes entraron en contacto, como pomos de puertas, mandos a distancia de televisión. controles, teléfonos, pisos y ropa de cama2,3. Por lo tanto, las partículas de SARS-CoV-2 en las superficies de diversos materiales pueden ser una fuente de infección, hipótesis que ha sido respaldada por varios estudios epidemiológicos4,5. La cantidad de virus en una superficie y el tiempo que los virus sobreviven en los materiales son cruciales para la transmisión indirecta.

Varios factores, como la humedad relativa, la temperatura y las propiedades de la superficie de un material, afectan la cantidad de virus infeccioso que se puede recuperar de una superficie. Varios grupos han estudiado la recuperación del SARS-CoV-2 infeccioso de las superficies de diversos materiales6,7,8,9,10, con resultados diferentes. Estas diferencias pueden ser atribuibles a diferencias en las condiciones experimentales. La humedad relativa y la temperatura influyen en la evaporación de los fluidos que contienen partículas de virus. Con respecto a la estructura o rugosidad de la superficie, investigadores anteriores han utilizado los términos "poroso" o "no poroso" para referirse a las superficies de los materiales, indicando una textura rugosa y gruesa o lisa de la superficie, respectivamente. Debido a que los materiales porosos, como el papel y las máscaras no tejidas, contienen múltiples ranuras y espacios, absorben fluidos y atrapan sustancias en el fluido. Por el contrario, el material no poroso no puede absorber fluidos. Por tanto, las propiedades de la superficie de un material influyen en gran medida en la cantidad de virus que se puede recuperar de una superficie. Aunque estudios anteriores utilizaron los mismos materiales, incluidos plástico y vidrio, los autores no describieron los detalles de los sustratos, como los tipos de plásticos, metales y madera, ni las características de las superficies de estos sustratos. A menos que los estudios utilicen materiales con características similares, los resultados variarán. Estudios anteriores han investigado principalmente materiales no porosos y hay pocos datos relacionados con materiales porosos. Sin embargo, en el transcurso de la vida diaria, las personas entran constantemente en contacto con materiales porosos como máscaras, billetes de banco, madera, ropa y papel. Otros factores pueden estar involucrados en la recuperación viral de los sustratos, además de la estructura o rugosidad de la superficie.

En estudios anteriores, el SARS-CoV-2 se detectó infectando células cultivadas o demostrando la presencia de ARN viral. La infección de células cultivadas demuestra directamente la presencia de virus infecciosos, pero la detección de ARN refleja la presencia de virus tanto infecciosos como no infecciosos. Por lo tanto, puede haber discrepancias entre el tiempo de recuperación del virus infeccioso medido por la infectividad y el medido por la presencia de ARN viral.

Para abordar estos problemas, preparamos varios sustratos de origen conocido y medimos la rugosidad de su superficie. Detectamos el virus utilizando tanto la infección de células cultivadas como la presencia de ARN viral. Los experimentos con SARS-CoV-2 deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL) 3. Para facilitar la investigación de una amplia gama de superficies diferentes, inicialmente utilizamos el coronavirus bovino (BCoV) manipulado en un laboratorio BSL2 como sustituto del SARS-CoV-2. Este virus pertenece al género Betacoronavirus, al igual que el SARS-CoV-2, reportado por estudios previos basados en el análisis filogenético molecular que BCoV es una de las especies más estrechamente relacionadas con el SARS-CoV-211. Después de clasificar las superficies en varias categorías, investigamos la capacidad de supervivencia del SARS-CoV-2 en las superficies de materiales caracterizados representativos.

Se midió la rugosidad de la superficie del área de cada sustrato representativo y se mostró como imágenes de microscopio en 3D (Fig. 1). Las observaciones microscópicas mostraron diferencias estructurales significativas en imágenes 3D entre sustratos porosos y no porosos en la escala de 100 μm. La rugosidad superficial del área (Sa; medida en µm) expresa, en valor absoluto, la diferencia de altura de cada punto respecto a la media aritmética de la superficie. Estos valores se muestran en la Tabla 1. Los valores de Sa sobre sustratos no porosos fueron 0,040 para vidrio flotado, 0,087 para resina acrílica, 0,101 para polipropileno, 0,102 para poliestireno, 0,113 para latón y polietileno de baja densidad, 0,131 para baldosas cerámicas, 0,150 para cloruro de polivinilo blando, 0,167 para acero inoxidable, 0,295 para resina de melamina y 0,458 para caucho de nitrilo. Los valores de Sa en sustratos porosos fueron 3,34 para papel de copia, 8,19 para tela de poliéster y 12,0 para chapa de lauan. Sa no era estructuralmente medible para la máscara no tejida.

Observación microscópica e imágenes 3D de la superficie de los sustratos (aumento × 20) investigadas en este estudio. Paneles (a) y (b), izquierda: observación microscópica; Derecha: imágenes en 3D sobre superficies de representantes de sustratos porosos y no porosos, respectivamente, investigados en este estudio. Panel (c), izquierda: apariencia y estructura transversal de la máscara no tejida, derecha: observación microscópica de dos capas de la máscara no tejida. No se pudo tomar la imagen 3D de la máscara no tejida porque su estructura era demasiado profunda.

En primer lugar, se midió la recuperación del virus de los sustratos utilizando el título infeccioso de BCoV como sustituto del SARS-CoV-2. La recuperación de virus infecciosos de superficies inoculadas con BCoV se muestra en la Fig. 2. Se determinó que el límite de detección (LoD) en el ensayo de título de virus era 0,4 log10 TCID50/ml. Debido a la citotoxicidad de la dilución más alta de virus recuperado del líquido de latón, caucho de nitrilo y chapa de lauan, se determinó que el LoD era 1,4 log10 TCID50/ml. Utilizando las pendientes de la línea de mejor ajuste, como se muestra en la Fig. 2, el tiempo hasta el LoD se calculó con un límite de detección de 1,0 log10 TCID50 como indicador de infectividad viral, suponiendo una disminución lineal en la recuperación viral basada en estudios similares7. 12 para todos los sustratos (Tabla 2). Para sustratos no porosos, los tiempos de LoD fueron 35 h para vidrio flotado, 81 h para resina acrílica, 62 h para polipropileno, 48 h para poliestireno, 4 h para latón, 65 h para polietileno de baja densidad, 22 h para cerámica. baldosas, 7 h para cloruro de polivinilo blando, 29 h para acero inoxidable y 25 h para resina de melamina. No se calculó el tiempo hasta el LoD para el caucho de nitrilo porque no se podía trazar su línea de mejor ajuste sin títulos de virus en más de dos puntos. Para sustratos no porosos, los tiempos hasta el LoD fueron 126 h para el papel de copia, 39 h para la tela de poliéster y 50 h para la máscara no tejida. No se pudo calcular el tiempo hasta el LoD para Lauan veneer porque no se pudo trazar su línea de mejor ajuste sin títulos de virus en más de dos puntos. Los sustratos probados se clasificaron en cinco grupos según el grado de recuperación de los virus infecciosos en la superficie: (1) vidrio flotado, resina acrílica, polipropileno, poliestireno y polietileno de baja densidad con altas recuperaciones de virus infecciosos en superficies no porosas. superficies; (2) baldosas de cerámica, acero inoxidable y resina de melamina con recuperaciones moderadas de virus infecciosos en superficies no porosas; (3) latón, cloruro de polivinilo blando y caucho de nitrilo con bajas recuperaciones de virus infecciosos en superficies no porosas; (4) mascarillas no tejidas con altas recuperaciones de virus infecciosos en superficies porosas; y (5) papel para fotocopias, tela de poliéster y chapa de lauan con baja recuperación de virus infecciosos en superficies porosas.

Recuperación del virus infeccioso de BCoV para todas las superficies de sustratos. Los títulos infecciosos de BCoV en las superficies de los sustratos se midieron como TCID50/ml por triplicado a las 0, 3, 6 y 18 h después de la inoculación, utilizando cultivo celular HRT-18G en placas de 96 pocillos. Las muestras a las 0 h se midieron inmediatamente después del secado. Los paneles A y B muestran sustratos porosos y no porosos, respectivamente. Los rombos indican los títulos medios del virus inoculado. Los círculos indican los títulos medios de los títulos infecciosos medidos. Las marcas cruzadas indican no detección (ND) por triplicado. Durante los ensayos, A-5) latón, A-11) caucho de nitrilo y B-3) chapa de lauan mostraron citotoxicidad, en la que el virus recolectado mató las células HRT-18G sin virus cuando se usaron colecciones sin diluir. Al calcular el valor medio, se consideró ND como 0 TCID50/mL para materiales no citotóxicos y 1 log10 TCID50/mL para materiales citotóxicos. El LoD y las líneas de puntos indican el límite de detección de los ensayos (LoD) en 0,4 log10 TCID50/mL para materiales no citotóxicos y 1,4 log10 TCID50/mL para materiales citotóxicos. Los números entre paréntesis junto a las marcas que incluyen los datos debajo del LoD indican el número de veces por encima del LoD por triplicado. Las barras indican las desviaciones estándar del virus inoculado o recolectado. Las líneas en negrita indican la tasa de disminución del virus, calculada mediante regresión lineal.

Se seleccionó un sustrato de cada uno de los cinco grupos de sustratos probados, clasificados según el grado de viabilidad de BCoV: poliestireno, baldosas de cerámica, cloruro de polivinilo blando, papel de copia y máscara no tejida, y se utilizó para experimentos adicionales con SARS-CoV- 2. Las recuperaciones de virus infecciosos de las superficies inoculadas con SARS-CoV-2 se muestran en la Fig. 3. A partir de las pendientes de las líneas de mejor ajuste en la Fig. 3, el tiempo hasta el LoD se calculó con un límite de detección de 1,0 log10 TCID50. /ml para todos los sustratos, y estos valores se muestran en la Tabla 2. Para sustratos no porosos, los tiempos hasta el LoD fueron 18 h para poliestireno, 11 h para baldosas cerámicas y 3 h para cloruro de polivinilo blando. Para sustratos no porosos, el tiempo hasta el LoD fue de 19 h para la máscara no tejida. La línea de mejor ajuste para papel de copia no fue aplicable debido a su pendiente ascendente. Nuestros resultados indicaron que en las superficies no porosas, la viabilidad del virus fue más alta en polietileno, moderada en baldosas de cerámica y más baja en cloruro de polivinilo blando. En las superficies porosas, la viabilidad del virus fue mayor en las mascarillas no tejidas y menor en el papel de copia.

Recuperación del virus infeccioso SARS-CoV-2 de todas las superficies de sustratos. Los títulos infecciosos de SARS-CoV-2 se midieron como TCID50/ml por triplicado a las 0, 3, 6, 12 y 24 h después de la inoculación, utilizando cultivos celulares VeroE6/TMPRSS2 en placas de 96 pocillos. Las muestras a las 0 h se midieron inmediatamente después del secado. Los ejes y izquierdo y derecho indican el título infeccioso (log10 TCID50/ml) y el número de copias de ARN (log10 copias de ARN/ml) del virus, respectivamente. Los rombos rojos cerrados y azules abiertos indican los títulos medios y el número de copias de ARN del virus inoculado, respectivamente. Los círculos cerrados y abiertos indican los títulos medios de los títulos infecciosos medidos y el número medio de copias de ARN del virus, respectivamente. Las marcas cruzadas indican no detección (ND) por triplicado. Al calcular el valor medio, se consideró ND como 0 DICT50/mL. Las líneas horizontales finas y punteadas significan el límite de detección de los ensayos (LoD) en 0,6 log10 TCID50/ml para el título de virus y 4,8 log10 copias de ARN/ml para RT-PCR, respectivamente. Los números entre paréntesis al lado de los puntos que incluyen los datos debajo del LoD indican el número de veces por encima del LoD por triplicado. Las barras indican las desviaciones estándar del virus inoculado o recolectado. Las líneas discontinuas y las líneas gruesas indican la tasa decreciente del virus, calculada mediante regresión lineal.

Los dos virus tenían características comunes; la recuperación del virus solo de las superficies del papel de copia se redujo significativamente en aproximadamente 4 log10 TCID50/mL en T = 0. Además, comparamos las tasas decrecientes de SARS-CoV-2 y BCoV en poliestireno, cerámica, cloruro de polivinilo blando y no -máscara tejida utilizando la prueba t de muestras pareadas de dos caras; SARS-CoV-2 y BCoV no mostraron significación en la comparación de las tasas decrecientes (p = 0,1015).

Los números de copias del ARN del SARS-CoV-2 en las superficies de cada sustrato se cuantificaron mediante RT-PCR en tiempo real (Fig. 3). El inóculo contenía 8,2 log10 copias de ARN/ml, y el número restante de ARN del SARS-CoV-2 disminuyó con el tiempo en los cinco sustratos. El número de copias del virus se redujo considerablemente de 8,2 a 5,6 log10 copias de ARN/ml después de 0 h en papel de copia. El LoD en este ensayo de RT-PCR fue de 4,8 log10 copias de ARN/ml (Tabla 2) y se alcanzó a las 145, 78, 36, 64 y 129 h en poliestireno, baldosas de cerámica, cloruro de polivinilo blando, papel de copia y materiales no convencionales. -máscara tejida, respectivamente. Los residuos de ARN del SARS-CoV-2 en la superficie permanecieron entre 7 y 12 veces más que los de los títulos infecciosos.

Varios investigadores han informado que los virus patógenos derivados de pacientes, como el virus de la influenza, el SARS-CoV y el SARS-CoV-21,2,13,14, se adhieren a las superficies de los artículos domésticos en su entorno y los virus infecciosos pueden recuperarse. . Dado el posible riesgo de infección por SARS-CoV-2 al adherirse a las superficies de objetos tocados por muchas personas, es importante evaluar cuantitativamente el tiempo que permanece la infectabilidad.

Llevamos a cabo una evaluación integral, centrándonos en la recuperación de BCoV y SARS-CoV-2 infecciosos de diversas superficies. En el Cuadro 3, la recuperación se clasifica en tres tipos. "Alta recuperación y mantenimiento" significa que la recuperación del virus infeccioso de la superficie estaba en un nivel alto a las 0 h después del secado del inóculo viral, y que el virus infeccioso se mantuvo durante un tiempo relativamente largo. El tipo "de disminución rápida" significa que la recuperación de virus infeccioso de la superficie a las 0 h después del secado del inóculo viral no disminuyó considerablemente, pero el virus infeccioso se inactivó inmediatamente, o que la recuperación de virus infeccioso de la superficie a las 0 h h después del secado, el inóculo viral disminuyó notablemente y el virus infeccioso se inactivó inmediatamente. El tipo "mantener a bajo nivel" significa que la recuperación del virus infeccioso de la superficie disminuyó notablemente a las 0 h después del secado del inóculo viral, y luego se mantuvo durante un tiempo muy largo en una concentración baja.

En este estudio investigamos la recuperación de BCoV infeccioso de 15 sustratos. La Sa de los sustratos no porosos medidos en este estudio osciló entre 0,040 y 0,458 μm (Tabla 1). No hubo correlación entre Sa y la tasa de recuperación del virus infeccioso, lo que sugiere que la rugosidad de la superficie no tuvo un efecto directo sobre la supervivencia del virus. Los niveles de recuperación de BCoV infeccioso después de la adhesión a la superficie fueron diferentes entre sustratos con características físicas similares (Fig. 2, Tabla 2). Por ejemplo, entre los sustratos metálicos, la disminución en la recuperación de virus infecciosos del latón fue significativamente mayor que la del acero inoxidable. Una posible explicación para esta observación es la inactivación del virus por iones de cobre15. El nivel de recuperación viral de las superficies de los sustratos de resina plástica a las 0 h después del secado del inóculo viral fue relativamente alto entre los sustratos probados en este estudio (Tabla 2; diferencia del título de virus entre el momento de la inoculación y a las 0 h). por lo que la capacidad de estos sustratos para disminuir las partículas de virus podría ser relativamente baja. No obstante, la cantidad de virus infecciosos en el caucho de nitrilo y el cloruro de polivinilo blando disminuyó más rápidamente que en otros sustratos de resina plástica. Se utilizan varios aditivos en el caucho de nitrilo y el cloruro de polivinilo blando. Parece que la solución de estos aditivos, como plastificantes y aceleradores de antioxidantes y vulcanización16,17,18, a partir de estos sustratos podría afectar la supervivencia viral. De hecho, los aceleradores de vulcanización de tipo tiuram (p. ej., disulfuro de tetrametiltiuram) también se utilizan como fungicidas19, y también se ha informado que el caucho de nitrilo tiene actividad biocida20. Por lo tanto, evaluamos el tipo de tendencia de recuperación de virus infecciosos en latón, cloruro de polivinilo blando y caucho de nitrilo como "rápidamente decreciente" (Tabla 3).

Con respecto a los sustratos porosos, excluyendo la máscara no tejida, las diferencias en los títulos virales entre el momento de la inoculación viral y las 0 h después del secado del inóculo del vial en las superficies de papel de copia, tela de poliéster y chapa de lauan fueron 3,0. 3,3 y 3,7, respectivamente (Tabla 2). Estas diferencias fueron mucho mayores que las de los materiales no porosos, excluyendo el caucho de nitrilo, y las recuperaciones virales cayeron inmediatamente a un nivel muy bajo. Sin embargo, las pendientes de las líneas de mejor ajuste del cambio en los títulos de SARS-CoV-2 y BCoV en estos sustratos porosos fueron mayores que las de otros sustratos, incluidos los sustratos no porosos probados en este estudio. Se detectó BCoV infeccioso en papel de copia y tela de poliéster incluso 18 h después del secado de la inoculación del virus (Fig. 2), y el tiempo hasta el LoD de BCoV en papel de copia se calculó en 126 h (Tabla 2). Las recuperaciones de virus infecciosos de estos sustratos porosos se mantuvieron durante mucho tiempo en un nivel bajo. Por lo tanto, evaluamos el tipo de tendencia de recuperación de virus infecciosos en ellos como "mantener en un nivel bajo" (Tabla 3).

En las máscaras no tejidas, hubo pequeñas diferencias en el título viral entre el momento de la inoculación y las 0 h después del secado del inóculo del vial (Tabla 2). Este resultado sugirió que el virus infeccioso en la superficie de las máscaras no tejidas era más fácil de recuperar que el de otros sustratos porosos, como tela de poliéster, chapa de lauan y papel de copia. Las partículas virales no pudieron disminuir en la máscara no tejida y se recuperaron más fácilmente que en otros sustratos porosos. Una posible explicación es que los espacios en el tejido de la superficie eran demasiado gruesos para absorber el inóculo viral (Fig. 1). Las partículas virales se volvieron imposibles de recolectar en papel de copia, tela de poliéster y chapa de lauan. La estructura 3D de las superficies del sustrato podría afectar la recuperación viral. En este estudio no se pudo tomar una imagen 3D de la máscara no tejida porque la estructura era demasiado profunda (Fig. 1). En el futuro, será necesario examinar la relación entre la estructura a nivel macroscópico en lugar de microscópico y la actividad viral de cada capa en las máscaras no tejidas. Otra explicación es que el polipropileno, materia prima de las mascarillas no tejidas, es un polímero hidrófobo, mientras que el papel y la madera son sustancias hidrófilas. El carácter hidrofóbico del polipropileno puede haber impedido que el inóculo viral empapara la tela no tejida.

Por lo tanto, estos resultados sugieren que la rugosidad de la superficie no tuvo un efecto directo sobre la supervivencia viral, y los niveles de recuperación de virus infecciosos de las superficies variaron entre sustratos con características físicas similares. Esperamos aclarar las propiedades fisicoquímicas que tienen el mayor efecto en la recuperación viral, utilizando el mismo material con diferentes texturas superficiales, repelencias al agua superficial y aditivos, en el futuro.

El tiempo hasta el LoD con SARS-CoV-2 para la mascarilla no tejida fue de 19 h. Este fue el tiempo más largo entre los cinco sustratos probados en este estudio, incluidos sustratos no porosos como poliestireno y baldosas de cerámica (Tabla 2). Por lo tanto, evaluamos el tipo de tendencia de recuperación de virus infecciosos como “alta recuperación y mantenimiento” (Tabla 3). Katsumi et al. mostraron que el título de SARS-CoV-2 en hisopos nasofaríngeos de pacientes era ocasionalmente superior a 6 log10 TCID50/mL21,22. Porque reducir 3,53 log10 TCID50/mL de SARS-CoV-2 en la máscara no tejida al LoD (0,6 log10 TCID50/mL) tomó 21,5 h, según lo calculado a partir de la pendiente de la línea de mejor ajuste para la máscara no tejida. En este estudio (Tabla 2), la disminución de 6 log10 TCID50/mL de virus en la máscara no tejida hasta el límite de detección tomaría 38,3 h. Este cálculo indica la posibilidad de que el SARS-CoV-2 en las mascarillas no tejidas utilizadas por los pacientes sobreviva uno o dos días. La necesidad de tener precaución al manipular mascarillas usadas es clara. Sin embargo, no existe una relación directa entre nuestros resultados y la eficacia de las máscaras no tejidas para prevenir la exposición a partículas virales del aire exterior o para bloquear la liberación de virus al aire desde los sistemas respiratorios de los pacientes.

van Kampen et al.21 informaron que la eliminación del virus infeccioso de los pacientes con COVID-19 continúa hasta 20 días después de la aparición de los síntomas, con una duración media de 8 días. Por lo tanto, existe el riesgo de que se peguen virus infecciosos de los pacientes a los objetos cotidianos, que podrían ser focos de infección por transmisión por contacto. Debemos tener cuidado al desinfectar las superficies de los sustratos clasificados como “alta recuperación y mantenimiento” en nuestra Tabla 3. El tiempo hasta el LoD para el título infeccioso de poliestireno y mascarilla no tejida, los sustratos con mayor tasa de recuperación de SARS infeccioso -CoV-2, se calculó que era 18 o 19 h después del secado del inóculo viral, con un título viral de aproximadamente 4 log10 TCID50/mL (Tabla 2). Si los virus con un título más alto que este se adhieren a las superficies, el virus infeccioso podría sobrevivir más tiempo. Esta observación sugiere que debemos prestar atención al desinfectar artículos fabricados con estos sustratos.

La discrepancia entre la detección de ARN y la recuperación de partículas virales infecciosas sugiere que la pérdida de viabilidad del virus en estos sustratos fue mucho más rápida que la disminución de la cantidad de ARN. Por tanto, la detección de ARN no es adecuada como marcador de la presencia de virus infecciosos. Anteriormente se ha indicado que se detectó ARN viral en diversas superficies tocadas por pacientes con SARS-CoV-23,4,5,9. Una investigación en un crucero informó que se podía detectar ARN viral 17 días después de la salida de los pacientes3. Sin embargo, como demostramos en este estudio, la detección de ARN viral no garantizó la recuperación de partículas virales infecciosas. Nuestro cálculo sugiere que el SARS-CoV-2 en máscaras no tejidas tocadas por los pacientes puede mantener la infectividad durante solo 38,3 h, como se analizó anteriormente. Por lo tanto, la transmisión del SARS-CoV-2 a través de las superficies de sustratos ambientales puede exagerarse utilizando la detección de ARN como marcador del virus. Se debe considerar la diferencia entre la detección de ARN viral y la recuperación de partículas virales infecciosas para comprender la transmisión ambiental del virus.

Este sistema de experimentos para confirmar la disminución gradual en la recuperación de virus infecciosos en la superficie de los sustratos de prueba utilizando BCoV demostró ser útil como alternativa al SARS-CoV-2. Los experimentos con SARS-CoV-2 deben realizarse en un laboratorio BSL3. Sin embargo, BCoV se puede manipular en un laboratorio BSL2, lo que permite realizar experimentos de forma segura. Es significativo que hayamos establecido un sistema experimental que utiliza BCoV como método de detección. Debido a que comparamos la dinámica de supervivencia de los dos virus, y nuestros resultados con BCoV produjeron la misma tendencia que los del SARS-CoV-2, se demostró que el BCoV era valioso como virus modelo para probar la recuperación del SARS-CoV-2 infeccioso. CoV-2 de superficies.

En este estudio se utilizó la cepa BCoV CS5 aislada de un hisopo nasal de ganado que mostraba síntomas respiratorios leves en Japón23. La muestra del hisopo nasal fue tomada por veterinarios clínicos de acuerdo con las pautas de ética animal de la Asociación de Ayuda Mutua Agrícola de Miyazaki para fines diagnósticos y terapéuticos bajo el consentimiento del propietario. El veterinario de la Universidad de Miyazaki aisló la cepa viral de la muestra de hisopo con la aprobación del Comité de Gestión de la Unidad de Investigación de Enfermedades Infecciosas del Centro para el Control de Enfermedades Animales. El SARS-CoV-2; La cepa 2019-nCoV JPN/TY/WK-521 se obtuvo del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas de Japón.

Para la propagación de BCoV, se cultivaron células HRT-18G en medio Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM-alto nivel de glucosa; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con FBS al 10 % (Bovogen Biologicals Pty Ltd., Keilor, Australia). ) y 1% de antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific)23. Los cultivos de virus y células se mantuvieron durante 5 días a 37 °C en CO2 al 5% y se recogieron los sobrenadantes y lisados celulares. El virus se concentró y se purificó mediante ultracentrifugación utilizando el método del gradiente de densidad de sacarosa24,25 y se suspendió en agua destilada de calidad HPLC (Kanto Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón). El BCoV purificado se diluyó diez veces en DMEM con alto contenido de glucosa con los suplementos descritos anteriormente y se utilizó en experimentos de inoculación en superficies.

Para la propagación del SARS-CoV-2, se cultivaron células VeroE6/TMPRSS2 (JCRB 1819) en medio Eagle modificado por Dulbecco con bajo nivel de glucosa (DMEM-bajo nivel de glucosa; Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de FBS, 2,5 µg/ml de disulfato acuoso de G418. (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japón) y 1% Antibiótico-Antimicótico7,26. Después de 5 días a 37 °C en CO2 al 5 %, se recogieron los sobrenadantes celulares y el virus, se diluyeron diez veces en DMEM con bajo contenido de glucosa sin suplementos y se utilizaron en experimentos de inoculación en superficies.

En este estudio se probaron las superficies de 15 sustratos disponibles comercialmente que representan una variedad de superficies en entornos habitables (Tabla complementaria S1). Estos sustratos fueron adquiridos en el mercado. Una pieza de vidrio flotado de 5 por 5 cm, resina acrílica, polipropileno, poliestireno, latón C2801 (Cu 60%, Zn 40%), polietileno de baja densidad, baldosas cerámicas, policloruro de vinilo blando, acero inoxidable SUS430, resina de melamina y nitrilo. En las pruebas de inoculación se utilizaron caucho y un sustrato poroso de chapa de lauán. En las pruebas de inoculación se utilizaron tres piezas de 1 por 1 cm de sustratos porosos: papel de copia, tela de poliéster y máscara no tejida hecha de polipropileno (incluidas todas las capas interior y exterior). Las muestras se esterilizaron utilizando gas óxido de etileno. Los experimentos se realizaron para cada superficie por triplicado.

La rugosidad superficial del área (μm), que expresa, en valor absoluto, la diferencia de altura de cada punto respecto a la media aritmética de la superficie, se midió utilizando un microscopio 3D VK-X1000 de Keyenece (Osaka, Japón). El campo de imagen fue de 705 µm en el eje X y de 528 µm en el eje Y (aumento × 20). Sa se calculó como el valor promedio de las mediciones tomadas en ocho superficies de observación no superpuestas en la superficie de la muestra (n = 8).

En las pruebas con BCoV, se realizaron pruebas de inoculación de virus utilizando los 15 sustratos (Tabla complementaria S1). En las pruebas con SARS-CoV-2, se realizaron pruebas de inoculación del virus utilizando cinco muestras seleccionadas con referencia a los resultados experimentales del BCoV; poliestireno, baldosas de cerámica, cloruro de polivinilo blando, papel de copia y máscara no tejida. La prueba de inoculación y recuperación viral se realizó sobre estas superficies de sustratos haciendo referencia a estudios previos12,27,28. Se colocaron un trozo de sustrato de 5 por 5 cm o tres trozos de sustrato de 1 por 1 cm en una placa de Petri de vidrio estéril. Se cargaron sesenta microlitros de inóculo viral divididos en seis a doce puntos en el centro de una superficie. La placa de Petri se abrió y se dejó secar en un gabinete de seguridad durante aproximadamente 60 min.

Después del secado, el sustrato se colocó en una placa de Petri de vidrio en una incubadora de temperatura y humedad constantes a 75 % de humedad relativa y 25 °C (humedad media anual del aire exterior en Tokio, Japón, en 2018 y 2019, según lo publicado por la Agencia Meteorológica de Japón). )29. BCoV se recuperó en cuatro momentos; tiempo 0 (inmediatamente después del secado) y después de 3 h, 6 h y 18 h, en gotas de 300 µl de DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 1 % de FBS, 1 % de antibiótico-antimicótico y 2,5 µg/ml de pancreatina (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Richmond, VA, EE. UU.) pipeteando sobre la superficie durante un minuto y recogiendo la mayor cantidad posible de líquido en un microtubo. El SARS-CoV-2 se recuperó en cinco momentos; tiempo 0 h (inmediatamente después del secado), y después de 3 h, 6 h, 12 h y 24 h, en gotas de 300 µL de DMEM-bajo en glucosa suplementado con 1% FBS, 2,5 µg/ml G418 y 1% Antibiótico-Antimicótico pipeteando sobre la superficie durante un minuto y recogiendo la mayor cantidad posible de líquido en un microtubo. Cada recuperación de virus se repitió dos veces en cada superficie y se recogió un total de 600 µl de inóculo. Los controles negativos consistieron en las mismas superficies sin inoculación previa del virus. Se comparó el título de virus infeccioso en una recuperación recolectada en cada momento para evaluar la eficiencia de la recuperación de virus infecciosos. Este experimento se repitió por triplicado.

Las cantidades de virus infecciosos en todas las superficies se cuantificaron mediante titulación de punto final con una dilución en serie diez veces de recuperación de virus en DMEM con los suplementos descritos anteriormente. Se inoculó SARS-CoV-2 en monocapas nuevas de células (Vero E6/TMPRSS2) en una placa de 96 pocillos. El cultivo se mantuvo durante 4 días a 37˚C en 5% de CO2. Se inoculó BCoV en monocapas nuevas de células HRT-18G en una placa de 96 pocillos. El cultivo se mantuvo durante 6 días a 37˚C en 5% de CO2. Después de la incubación, las células se controlaron para detectar el efecto citopático inducido por virus (CPE). Los títulos de virus se calcularon mediante el método de Reed-Muench30.

Cuando los títulos estaban por debajo del límite de cuantificación del método de Reed-Muench, el valor del título se estimó dividiendo el número de pocillos en los que apareció CPE por los volúmenes equivalentes de líquido de recuperación sin diluir en un ensayo (por ejemplo, 1 pocillo de CPE en 0,22222 ml). de volumen equivalente sin diluir en un ensayo de título viral conduce a 0,65 log10 TCID50/ml). La citotoxicidad se observó con la dilución más alta de un virus que recuperaba líquido de tres tipos de sustratos, como latón, caucho de nitrilo y chapa de lauan. Utilizando esta estimación, el LoD en el ensayo de título viral se determinó como 0,6 log10 TCID50/mL para SARS-CoV-2, 0,4 log10 TCID50/mL para BCoV con materiales no citotóxicos y 1,4 log10 TCID50/mL para BCoV con sustratos citotóxicos. , como se describió anteriormente. Un ensayo sin CPE se consideró ND. Para el cálculo de los valores medios y las desviaciones estándar de los títulos, se consideró ND como 0 DICT50/mL. Las líneas de disminución de los títulos se calcularon mediante regresión lineal utilizando los títulos medios, excluyendo todos los datos de ND en un momento determinado. Para la comparación de tasas decrecientes, se realizó una prueba t bilateral para muestras pareadas con un nivel de significancia de p <0,05.

Los ARN virales se extrajeron de las recuperaciones de SARS-CoV-2 de superficies utilizando los mini kits de ARN viral QIAamp (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La RT-PCR se realizó utilizando kits de RT-PCR One Step PrimeScript con el conjunto de cebador/sonda N2 (Takara Bio, Shiga, Japón)31. Las condiciones de ciclado fueron: transcripción inversa durante 5 min a 42 °C, desnaturalización inicial durante 10 s a 95 °C, luego 45 ciclos de 5 s a 95 °C y 30 s a 60 °C en un Applied Biosystems 7500 Real-Time. Sistema PCR (Thermo Fisher Scientific). Para cuantificar los números de copias de ARN viral, se generó una curva estándar utilizando una mezcla de ARN de control positivo (2019-nCoV; Takara Bio). El tiempo hasta el LoD para el SARS-CoV-2 se calculó con un límite de detección de 4,8 log10 copias de ARN/ml para todos los sustratos.

Los autores confirman que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en este artículo y su material complementario.

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Estos autores contribuyeron por igual: Maiko Watanabe, Takahiro Ohnishi y Sakura Arai.

División de Microbiología, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, Kanagawa, 210-9501, Japón

Maiko Watanabe, Takahiro Ohnishi, Sakura Arai, Katsuhiko Hayashi, Kenji Ohya, Shouhei Hirose, Tomoya Yoshinari y Yukiko Hara-Kudo

División de Química Ambiental, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, Kanagawa, 210-9501, Japón

Tsuyoshi Kawakami y Yoshiaki Ikarashi

Laboratorio de Microbiología, Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad de Azabu, Kanagawa, 252-5201, Japón

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Takahide Taniguchi

Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, Kanagawa, 210-9501, Japón

Masamitsu Honma y Yukihiro Goda

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MW y YH-K. diseñó el estudio. MW, TO, SA, TK, KH, KO, SH, TY y YH-K. desarrolló la técnica y llevó a cabo los experimentos. MW, TO, SA, TK, KH, KO, SH, TY, YI y YH-K. analizó los datos. MW, TO, SA, TK, KH, KO, HM, YI y YH-K. preparó el manuscrito. ST, HM y TT proporcionaron reactivos y soporte técnico. MH y YG supervisaron el proyecto. MH, YG y YH-K. proporcionó financiación. Todos los autores aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Yukiko Hara-Kudo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Watanabe, M., Ohnishi, T., Arai, S. et al. Supervivencia del SARS-CoV-2 y del coronavirus bovino en superficies comunes de entornos habitables. Informe científico 12, 10624 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14552-9

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Recibido: 25 de febrero de 2022

Aceptado: 08 de junio de 2022

Publicado: 23 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14552-9

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